Peter Parker ha finalmente trovato l'equilibrio che desiderava da tempo tra l'amore per Mary Jane Watson e le sue responsabilità come Uomo Ragno. La città di New York e i suoi cittadini stanno finalmente apprezzando tutto ciò che ha fatto come suo alter ego per combattere il crimine e Peter è in corsa per un posto di lavoro al Daily Bugle. Tuttavia, tutto ciò per cui Peter ha lavorato sta per essere distrutto. Flint Marko, mentre fugge dalla prigione, rimane coinvolto in un incidente che sposta le molecole e si trasforma nell'Uomo della Sabbia, un nuovo supercriminale in grado di cambiare il proprio corpo in qualsiasi forma di sabbia ritenga opportuno. Quando Peter scopre un collegamento tra l'Uomo Sabbia e l'omicidio di suo zio Ben, non si fermerà davanti a nulla come Spider-Man per catturarlo. Ma prima che Peter possa farlo, scopre che una misteriosa sostanza nera ha reso nera la sua tuta e ha fatto emergere un lato più oscuro di Parker e di Spidey che nessuno aveva mai visto prima. Peter inizia a cedere a questa nuova personalità oscura, inizia ad abbandonare le persone che ama di più e a sua volta il suo migliore amico Harry Osborn assume il ruolo di New Goblin, il mantello del suo defunto padre. Rapidamente Parker inizia una nuova storia d'amore con la sua compagna di laboratorio, la bella Gwen Stacy, ma così facendo Peter mette in allarme un fotografo del Bugle rivale, un giovane problematico di nome Eddie Brock, ossessionato da Stacy. Peter non sa che la sostanza nera ha messo gli occhi anche su Eddie. Trasforma Brock in Venom, un nemico che rispecchia tutto ciò che Spider-Man può fare. Costringendo Peter a diventare l'eroe volitivo che ha dimenticato se vuole sconfiggere la minaccia più grande che abbia mai incontrato. Data di uscita negli Stati Uniti: 3 maggio 2007.
Lo sviluppo di Spider-Man 3 è iniziato subito dopo il successo di Spider-Man 2 per un'uscita nel 2007. Durante la pre-produzione, Raimi voleva inizialmente due cattivi, Harry Osborn e Sandman. Su richiesta del produttore Avi Arad, aggiunse Venom alla lista e i produttori chiesero anche l'aggiunta di Gwen Stacy. Le riprese principali del film sono iniziate nel gennaio 2006 e si sono svolte a Los Angeles e Cleveland prima di spostarsi a New York City da maggio a luglio 2006. Dopo agosto sono state effettuate altre riprese e il film è stato terminato nell'ottobre 2006. Durante la post-produzione, Sony Pictures Imageworks ha creato oltre 900 riprese di effetti visivi. Con un budget di produzione stimato di 258-350 milioni di dollari, il film è stato il più costoso mai realizzato al momento della sua uscita.
Spider-Man 3 è stato presentato in anteprima il 16 aprile 2007 a Tokyo ed è stato distribuito negli Stati Uniti nelle sale convenzionali e IMAX il 4 maggio 2007. Il film ha incassato 894,9 milioni di dollari in tutto il mondo, diventando il film di maggior incasso della trilogia, il terzo film di maggior incasso del 2007 ed è stato il film di Spider-Man di maggior incasso fino a quando non è stato superato da Spider-Man: Far From Home nel 2019. Nonostante sia stato un successo al botteghino, ha ricevuto recensioni generalmente contrastanti da parte della critica. Una versione riveduta del film, intitolata Spider-Man 3: Editor's Cut, è stata distribuita in home entertainment e in digital download il 13 giugno 2017.
Un quarto capitolo, intitolato Spider-Man 4, doveva uscire il 6 maggio 2011, seguito da un film spin-off su Venom, ma entrambi sono stati cancellati. La serie cinematografica di Spider-Man è stata riavviata due volte: prima con The Amazing Spider-Man (2012) di Marc Webb e con Andrew Garfield; poi con una nuova serie di film ambientati nel Marvel Cinematic Universe (MCU) diretti da Jon Watts e con Tom Holland, a partire da Spider-Man: Homecoming (2017). Spider-Man: No Way Home (2021) ha esplorato il concetto di multiverso per collegare i film e i personaggi precedenti al MCU, con Maguire e Church che hanno ripreso i loro ruoli nel film.
Un anno dopo la morte di Otto Octavius, Peter Parker progetta di chiedere a Mary Jane Watson, che ha fatto il suo debutto a Broadway, di fare un musical. A Central Park, una meteora atterra vicino ai due e un simbionte extraterrestre segue Peter fino al suo appartamento attaccandosi alla sua moto. Harry Osborn, sapendo che Peter è Spider-Man, cerca di vendicare la morte del padre. Utilizzando il gas per migliorare le prestazioni del padre e la tecnologia di Green Goblin, combatte contro Peter fino a raggiungere uno stallo, sviluppando un'amnesia parziale. Nel frattempo, la polizia insegue l'evaso Flint Marko, che visita la moglie e la figlia malata prima di fuggire. Cadendo in un acceleratore di particelle sperimentale che fonde il suo corpo con la sabbia circostante, ottiene la capacità di controllare e riformare il suo corpo con la sabbia, diventando Sandman.
Durante un festival che onora l'Uomo Ragno per aver salvato la vita a Gwen Stacy, Peter la bacia per compiacere la folla, facendo arrabbiare Mary Jane. Marko rapina un furgone blindato e fugge dopo aver sconfitto l'Uomo Ragno. Il capitano della polizia di New York George Stacy, padre di Gwen, informa Peter e sua zia May che Marko è il vero assassino dello zio Ben; il defunto Dennis Carradine era il complice di Marko. Nell'appartamento, il simbionte assimila la tuta mentre Peter dorme con il suo costume da Spider-Man in attesa che Marko esca dal suo nascondiglio. Peter si risveglia in cima a un edificio e scopre che il simbionte ha colorato di nero la sua tuta e ha potenziato i suoi poteri, ma ha anche fatto emergere le parti più oscure della sua personalità.
Peter individua e combatte Marko in un tunnel fognario della metropolitana. Scoprendo che l'acqua è il suo punto debole, apre un tubo e rilascia l'acqua che riduce Marko in fango e lo lava via in una fogna. Il cambiamento di comportamento di Peter allontana Mary Jane, che riceve anche recensioni negative dalla critica. Condivide un momento di tenerezza con Harry ma se ne va dispiaciuta. Spinto da un'allucinazione del padre, Harry si riprende dall'amnesia e costringe Mary Jane a rompere con Peter. In seguito, Harry si incontra con Peter e gli dice che Mary Jane lo ama. Sotto l'influenza del simbionte, Peter affronta Harry e afferma con dispetto che suo padre non lo ha mai amato. Mentre Peter se ne va dopo una colluttazione, Harry gli lancia una zucca bomba; Peter la devia, sfigurando il volto di Harry.
Al Daily Bugle, Peter smaschera il fotografo rivale Eddie Brock, le cui foto false incriminano l'Uomo Ragno. L'editore J. Jonah Jameson licenzia Brock e promuove Peter a fotografo personale. Più tardi, Peter porta Gwen in un jazz club dove ora lavora Mary Jane. Nel tentativo di farla ingelosire, Peter interrompe l'esibizione di Mary Jane e balla con Gwen davanti a lei. Dopo aver capito di essere stata usata, Gwen si scusa con Mary Jane e se ne va. Dopo aver aggredito i buttafuori e colpito accidentalmente Mary Jane, Peter si rende conto che il simbionte lo sta corrompendo. Ritirandosi nel campanile di una chiesa e scoprendo che i suoni del metallo che tintinna indeboliscono la creatura, Peter rimuove il simbionte. Brock si trova nella stessa chiesa e diventa il nuovo ospite del simbionte.
Nei panni di Venom, Brock trova un Marko ancora vivo e lo convince a unire le forze per uccidere l'Uomo Ragno. Brock rapisce Mary Jane e la tiene prigioniera di una ragnatela in un cantiere, con l'intenzione di ucciderla per vendicarsi del fatto che Peter lo ha rovinato, mentre Marko tiene a bada la polizia. Dopo che Harry rifiuta di aiutare Peter, il maggiordomo di Harry rivela che la morte di Norman non è stata colpa dell'Uomo Ragno. Mentre Brock e Marko immobilizzano Peter, Harry arriva per aiutare Peter e salvare Mary Jane. Brock tenta di impalare Peter con l'aliante di Harry, ma Harry salta e viene impalato. Ricordando la debolezza del simbionte, Peter assembla un perimetro di tubi metallici per creare un attacco sonico, indebolendolo e permettendo a Peter di separare Brock dal simbionte.
Peter attiva una zucca-bomba e la lancia contro il simbionte senza ospite. Essendo diventato dipendente dalla sua influenza, Brock tenta di salvare il simbionte ed entrambi vengono vaporizzati. Marko spiega che la morte di Ben è stato un incidente che lo ha perseguitato e che tutto ciò che ha fatto è stato per aiutare sua figlia; Peter perdona Marko e gli permette di fuggire. Peter e Harry si riconciliano prima che quest'ultimo muoia per le ferite riportate. Qualche tempo dopo, Peter fa visita a Mary Jane al jazz club, dove si abbracciano e condividono un ballo.