Peter Parker trova un indizio che potrebbe aiutarlo a capire perché i suoi genitori sono scomparsi quando era giovane. Il suo percorso lo mette in rotta di collisione con il dottor Curt Connors, ex partner di suo padre.
Lo sviluppo del film è iniziato dopo la cancellazione di Spider-Man 4 nel gennaio 2010, che ha posto fine alla serie di film sull'Uomo Ragno del regista Sam Raimi che originariamente vedeva Tobey Maguire nei panni del supereroe titolare. Columbia Pictures ha scelto di riavviare il franchise con lo stesso team di produzione e Vanderbilt ha deciso di continuare a scrivere il prossimo film di Spider-Man, mentre Sargent e Kloves hanno collaborato alla sceneggiatura. Durante la pre-produzione, i personaggi principali sono stati scritturati nel 2010. Sono stati introdotti nuovi design rispetto ai fumetti, come gli spara-ragnatele artificiali. Utilizzando la macchina da presa RED Epic della Red Digital Cinema Camera Company, le riprese principali sono iniziate nel dicembre 2010 a Los Angeles per poi spostarsi a New York. Il film è entrato in post-produzione nell'aprile 2011. 3ality Technica ha fornito l'elaborazione delle immagini 3D, mentre Sony Pictures Imageworks si è occupata degli effetti CGI. Questo è stato anche l'ultimo film americano diretto da James Horner e distribuito durante la sua vita, tre anni prima della sua morte avvenuta il 22 giugno 2015 a causa di un incidente aereo, nonché il penultimo film del designer di produzione J. Michael Riva e di una delle produttrici Laura Ziskin, morti rispettivamente il 7 giugno 2012 e il 12 giugno 2011. L'ultimo film di J. Michael Riva come production designer è stato Django Unchained, uscito cinque mesi dopo, mentre l'ultimo film della Ziskin come produttrice è stato The Butler, uscito un anno dopo, nel 2013.
Sony Pictures Entertainment ha creato un sito web promozionale, pubblicando molte anteprime e lanciando una campagna di marketing virale. Tra i tie-in c'era anche un videogioco di Beenox e Activision. Il film è stato presentato in anteprima il 30 giugno 2012 a Tokyo ed è uscito negli Stati Uniti il 3 luglio, dieci anni dopo l'uscita di Spider-Man (2002), nei formati 2D, 3D e IMAX 3D. Il film ha ricevuto recensioni per lo più positive da parte della critica, che ha lodato l'interpretazione di Garfield nel ruolo di Spider-Man, la chimica tra Stone e Garfield, gli effetti visivi e la colonna sonora, ma ha criticato alcuni elementi della trama. Il film è stato un successo al botteghino e ha incassato 758 milioni di dollari in tutto il mondo, diventando il settimo film di maggior incasso del 2012. Il sequel, The Amazing Spider-Man 2, è uscito il 2 maggio 2014. Garfield e Ifans hanno ripreso i loro ruoli nel film del MCU Spider-Man: No Way Home (2021), che trattava il concetto di multiverso e collegava questo franchise ai capitoli di Raimi e Webb.
Un giovane Peter Parker scopre che lo studio di suo padre, il magnate degli affari Richard Parker, è stato svaligiato. I genitori di Peter raccolgono dei documenti nascosti, portano Peter a casa della zia May e dello zio Ben e se ne vanno misteriosamente. Anni dopo, Peter adolescente frequenta la Midtown Science High School; è intelligente ma socialmente impacciato e spesso vittima di bullismo. Ha anche una cotta per Gwen Stacy, che ricambia i suoi sentimenti.
Venendo a sapere che suo padre è amico del Dr. Curt Connors, uno scienziato della Oscorp che si occupa di genetica interspecie, Peter si intrufola nella Oscorp, dove viene morso da un ragno geneticamente modificato. In seguito scopre di aver sviluppato capacità simili a quelle dei ragni, come forza sovrumana, sensi acuti, agilità e velocità. Peter studia i documenti del padre e fa visita a Connors, il cui braccio destro è amputato sopra il gomito. Peter rivela di essere il figlio di Richard e consegna a Connors l'"algoritmo del tasso di decadimento" di suo padre, il pezzo mancante negli esperimenti di Connors sulla rigenerazione degli arti. A casa, Peter e Ben litigano e Peter se ne va. Mentre lo cerca, Ben cerca di fermare un ladro che Peter ha lasciato scappare e viene colpito da un proiettile, morendo tra le braccia di Peter. Peter usa le sue nuove capacità per rintracciare i criminali che corrispondono alla descrizione dell'assassino. Crea una maschera e una tuta in spandex per nascondere la sua identità. Costruisce anche degli spara-ragnatele meccanici con degli orologi da polso da attaccare alle braccia e ai polsi. A cena con la famiglia di Gwen, scopre che il padre di lei è il capitano di polizia George Stacy, che non vede di buon occhio il nuovo eroe vigilante.
Peter rivela la sua identità a Gwen e i due si baciano. Dopo aver visto il successo dei topi da laboratorio con il DNA di lucertola, il superiore di Connors, Ratha, chiede a Connors di iniziare immediatamente la sperimentazione sugli esseri umani. Connors si rifiuta di affrettare la procedura di sperimentazione e di mettere a rischio persone innocenti. Ratha licenzia Connors e decide di testare il suo siero in un ospedale della Veterans Administration. In un atto di disperazione, Connors prova la formula su se stesso. Dopo essere svenuto, si risveglia e scopre che il suo braccio mancante si è rigenerato. Scoprendo che Ratha si sta dirigendo verso l'ospedale, Connors va ad intercettarlo. Quando arriva al Williamsburg Bridge, si è trasformato in un violento rettile umanoide. Peter, ora chiamato Spider-Man, salva le persone sul ponte dall'attacco di Connors. Dopo una battaglia nelle fogne, Lizard scopre la vera identità dell'Uomo Ragno e attacca Peter a scuola. La polizia inizia una caccia all'Uomo Ragno e a Lizard. Alla fine mette Spider-Man alle strette e il Capitano Stacy scopre che Spider-Man è Peter e lo lascia andare per fermare Lizard. Lizard progetta di rendere rettili tutti gli esseri umani rilasciando una nube chimica dalla torre della Oscorp, per eliminare le debolezze che secondo lui affliggono l'umanità.
Gwen crea un antidoto che Peter disperde, riportando Connors e le sue vittime alla normalità, ma non prima che Lizard ferisca mortalmente il Capitano Stacy. Prima di morire, il Capitano Stacy chiede a Peter di evitare Gwen per tenerla al sicuro. Peter inizialmente lo fa, ma visto che sono entrambi infelici, le accenna che potrebbe vederla dopo tutto.
In una scena a metà dei titoli di coda, un Connors incarcerato parla con un uomo nell'ombra che gli chiede se Peter conosce la verità su suo padre. Connors non lo sa e chiede che Peter venga lasciato in pace, prima che l'uomo scompaia.